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01微生物檢測的項(xiàng)目及參考標(biāo)準(zhǔn)

1.1 衛(wèi)生指標(biāo)限度要求

根據(jù)進(jìn)口飼料和飼料添加劑登記管理辦法規(guī)定，申請(qǐng)進(jìn)口登記的飼料、飼料添加劑，應(yīng)當(dāng)符合生產(chǎn)地和中國的相關(guān)法律法規(guī)、技術(shù)規(guī)范的要求。目前，我國關(guān)于飼料及飼料添加劑的強(qiáng)制規(guī)定及標(biāo)準(zhǔn)有《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和寵物飼料衛(wèi)生規(guī)定。詳細(xì)檢測項(xiàng)目及限量見表1和表2。

1.2 功能性微生物

我國《飼料添加劑品種目錄》中有34種微生物可用于飼料和動(dòng)物養(yǎng)殖，常用于畜含及水產(chǎn)品養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母，以及它們混合后的飼料添加劑。

02微生物檢測的常見方法

我國部分微生態(tài)制劑檢測標(biāo)準(zhǔn)見表3。

2.1 平板菌落計(jì)數(shù)法

平板菌落計(jì)數(shù)法是定量檢測中最常使用的方法。平板菌落計(jì)數(shù)法分為兩種，一種為涂布法，一種為傾倒法。平板菌落計(jì)數(shù)法能準(zhǔn)確的檢測出樣本中的菌落個(gè)數(shù)，但是平板菌落法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且操作繁雜。

2.2 MPN法

MPN法，也稱作最有可能數(shù)法，是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論，估計(jì)樣本中微生物數(shù)量的一種方法，MPN法檢測出的數(shù)值，并不代表細(xì)菌的實(shí)際菌落數(shù)。

2.3 顯微鏡計(jì)數(shù)法

顯微鏡計(jì)數(shù)法是利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)微生物活菌數(shù)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，具有操作簡單、耗時(shí)短、成本低等特點(diǎn)。但用顯微鏡計(jì)數(shù)法檢測時(shí)，細(xì)菌的死活不易區(qū)分，數(shù)值容易出現(xiàn)誤差。

2.4 濾膜法

濾膜法是指將樣品經(jīng)微孔濾膜過濾后，將微孔濾膜置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而得到樣品中的菌落數(shù)目，此方法操作簡單、便捷，但是檢測精度不足，應(yīng)用范圍小。

2.5 PCR法

PCR法多用于定性檢測，可以通過對(duì)細(xì)菌的DNA或RNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其擴(kuò)增片段完成微生物種類的確證。PCR法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便、純度要求低等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些假陰性、假陽性等問題。

03微生物檢測常見問題及建議

3.1 細(xì)菌總數(shù)

進(jìn)口飼料及飼料添加劑檢測過程中，培養(yǎng)后的瓊脂表面會(huì)生成一層膜，這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程中，營養(yǎng)瓊脂和稀釋液混合均勻后，營養(yǎng)瓊脂還未冷卻就將平皿蓋蓋上，水汽揮發(fā)不出去，造成水汽過大。導(dǎo)致細(xì)菌在瓊脂表面蔓延生長，形成一層“膜”。

細(xì)菌總數(shù)在結(jié)果計(jì)數(shù)時(shí)，營養(yǎng)瓊脂表面菌落有時(shí)結(jié)片，一是細(xì)菌本身的菌落形態(tài)較大，二是因?yàn)榕囵B(yǎng)基的水汽過大，造成細(xì)菌蔓延生長。在做細(xì)菌總數(shù)檢測時(shí)，尤其是魚粉等細(xì)菌總數(shù)偏高的這一類產(chǎn)品，建議在平皿培養(yǎng)第二天進(jìn)行第一次計(jì)數(shù)作為參考，第三天再做最終計(jì)數(shù)。

3.2 霉菌總數(shù)

霉菌在培養(yǎng)7d后，菌落基本都比較大甚至還會(huì)長出菌絲和孢子，連成一片。雖然國標(biāo)13092中規(guī)定霉菌總數(shù)的計(jì)數(shù)范圍是每平板10~100，但在實(shí)際檢測過程中，若一個(gè)瓊脂板上生長70個(gè)霉菌培養(yǎng)7d靠肉眼無法分辨每一個(gè)菌落。在檢測進(jìn)口飼料和飼料添加劑過程中，要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求，從第四天開始，每天計(jì)數(shù)，每天記錄。

做霉菌總數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)，培養(yǎng)后的瓊脂板要平移，不要倒置，也不要振動(dòng)，防止孢子脫落，污染環(huán)境，危害人類健康。

3.3 大腸菌群

國標(biāo)18869中，檢測大腸菌群有兩種方法一是乳糖膽鹽發(fā)酵法，二是LST發(fā)酵法。在實(shí)際檢測過程中，兩種方法的選擇是有區(qū)別的。乳糖膽鹽法檢測耗時(shí)相對(duì)短，LST發(fā)酵法步驟少，但這兩種方法最大的差異，是乳糖膽鹽發(fā)酵法的限量要求是每100g(mL)，LST發(fā)酵法的限量要求是每g/mL。實(shí)際進(jìn)口飼料和飼料添加劑檢測過程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，選擇檢測方法。

在培養(yǎng)基配制時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)基試管內(nèi)都需要放置倒置管，為節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，可以直接把空的倒置管放在試管內(nèi)，然后分裝液體培養(yǎng)基，通過高壓滅菌并冷卻后，倒置管內(nèi)的氣體會(huì)自動(dòng)排空。在大腸菌群檢測過程中，培養(yǎng)基試管不可劇烈振動(dòng)，向試管內(nèi)添加樣品稀釋液的時(shí)候也不要注射過快，避免使倒置管內(nèi)產(chǎn)生氣泡，造成假陽性。

3.4 沙門氏菌

標(biāo)準(zhǔn)菌株是做進(jìn)口飼料和飼料添加劑微生物定性檢測必不可少的，在使用過程中，要時(shí)刻關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落形態(tài)，有污染和退化的現(xiàn)象時(shí)，要及時(shí)分離純化、復(fù)壯，必要時(shí)更換。在沙門氏菌檢測過程中，除了要比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落形態(tài)，還要根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)判斷是否為沙門氏菌陽性。

實(shí)驗(yàn)表明，不同廠家的培養(yǎng)基對(duì)沙門氏菌的檢出有很大的影響，韓鐫竹(2016)實(shí)驗(yàn)表明BPW對(duì)沙門氏菌的檢出率影響很大。在更換培養(yǎng)基時(shí)，要對(duì)新的培養(yǎng)基做驗(yàn)證，確實(shí)有效后，方可投入使用。

3.5 功能性微生物

幾種常見混合型微生態(tài)制劑的檢測方法見表4。

檢測微生態(tài)制劑功能性菌，不能根據(jù)菌落的典型特征確定細(xì)菌種類，一定要做生化鑒別確定細(xì)菌種類。

芽孢桿菌中還有孢子，容易對(duì)環(huán)境及其他的產(chǎn)品造成污染，且不宜除去，在檢測過程中，涉及芽孢桿菌的微生態(tài)制劑，應(yīng)使用單獨(dú)的耗材，如有條件，可使用一次性耗材。

采用涂布法進(jìn)行細(xì)菌菌落總數(shù)測定時(shí)，瓊脂板的制備特別關(guān)鍵，平板的制備時(shí)間要控制好例如孟加拉紅瓊脂板要多放置一段時(shí)間，使瓊脂表面的水分揮發(fā)，有利于樣品稀釋液的吸收；PDA瓊脂培養(yǎng)基水分揮發(fā)快，需要及時(shí)收起來不然平皿表面水分低，樣品稀釋液未涂布均勻就被瓊脂吸收了。

進(jìn)口飼料添加劑的某些功能菌檢測條件為厭氧，實(shí)驗(yàn)室可以配備厭氧培養(yǎng)箱，也可以配備厭氧罐和厭氧包，厭氧包在投入使用前要經(jīng)過嚴(yán)格的篩查。

來源：寵物食品聯(lián)盟